MODELAMIENTO COMPUTACIONAL DE LA CRUZIOSEPTINA CC-17
EXTRAÍDA DE LA RANA
Cruziohyla calcarifer
Reinoso et. al., 161–182
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MODELAMIENTO COMPUTACIONAL
DE LA CRUZIOSEPTINA CC-17 EXTRAÍDA
DE LA RANA Cruziohyla calcarifer
COMPUTATIONAL MODELING OF CRUZIOSEPTIN CC-17
EXTRACTED FROM THE FROG Cruziohyla calcarifer
Camila Reinoso D.
1
, Sebastián Cuesta H.
1
,
Carolina Proaño-Bolaños
2,3
& Lorena Meneses O.
1
*
Recibido: 29 de abril 2021 / Aceptado: 1 de julio 2021
10.26807/ia.v9i2.214
Palabras clave: acoplamiento molecular, anuro, exudado,
péptidos antimicrobianos, propiedades fisicoquímicas
Keywords: anuran, antimicrobial peptides, molecular docking,
physicochemical properties, skin secretion
RESUMEN
El inadecuado uso de antibióticos ha conducido a un aumento en la tasa de
resistencia bacteriana por esto ha sido fundamental el estudio de nuevos com-
puestos con propiedades bioactivas que permitan enfrentar el desafío ocasio-
1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Escuela de
Ciencias Químicas, Laboratorio de Química Computacional, Quito, Ecuador (dcrd-98@hotmail.es;
sebastian_cuesta@yahoo.com; *correspondencia: lmmeneses@puce.edu.ec)
2 Universidad Regional Amazónica IKIAM, Tena, Ecuador (carolina.proano@ikiam.edu.ec)
3 Queen´s University Belfast, School of Pharmacy, Natural Drug Discovery Group, Belfast, UK
(carolina.proano@ikiam.edu.ec)
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nado por la falta de fármacos efectivos para el tratamiento de infecciones cau-
sadas por un amplio rango de bacterias. En este sentido, el presente trabajo de
investigación se centra en el modelamiento computacional de la Cruzioseptina
CC-17 perteneciente a la familia de péptidos identificados en el exudado de la
rana Cruziohyla calcarifer. Inicialmente, se realizó la caracterización del pép-
tido en función de sus propiedades fisicoquímicas y la elucidación de su es-
tructura secundaria, asimismo, para analizar la actividad del péptido se
desarrolló el estudio de acoplamiento molecular de la Cruzioseptina CC-17
con enzimas presentes en Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida al-
bicans y con moléculas pertenecientes a la membrana celular bacteriana. Los
resultados muestran que la Cruzioseptina CC-17 es un péptido cuya estructura
secundaria está compuesta predominantemente por regiones alfa helicoidales
y presenta una carga de +2 lo cual le concede el carácter básico, presenta un
punto isoeléctrico de 8,6 y está compuesta en un 52,7 % por aminoácidos hi-
drofóbicos. Finalmente, el estudio de acoplamiento molecular demuestra que
la bioactividad del péptido puede explicarse en base a un mecanismo de ataque
focalizado en la membrana celular bacteriana en donde la lisis celular se logra
gracias a las interacciones electrostáticas entre la Cruzioseptina CC-17 con los
distintos componentes de la membrana bacteriana.
ABSTRACT
The inappropriate use of antibiotics has led to an increase in the rate of bacterial
resistance, therefore, the study of new compounds with bioactive properties
has been essential to face the challenge caused by the lack of effective drugs
for the treatment of infections caused by a wide range of bacteria. In this sense,
the present research work focuses on the computational modeling of Cruzio-
septin CC-17 belonging to the family of peptides extracted from the exudate of
the Cruziohyla calcarifer frog. Initially, the characterization of the peptide was
carried out based on its physicochemical properties and the elucidation of its
secondary structure. In addition, moleculardockingwas performedto analyze
the activity of the different enzymes present in Escherichia coli, Staphylococcus
aureus and Candida albicans and with molecules present in the bacterial cell
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membrane. The results show that Cruzioseptin CC-17 is a peptide which se-
condary structure is predominantly composed of alpha helical regions and has
a net charge of +2 which gives it the basic character, has an isoelectric point of
8.6 and is composed of a 52.7% by hydrophobic amino acids, which confirms
its cationic character. In the other hand, molecular docking results shows that
the bioactivity of the peptide can be explained based on a concentrated attack
mechanism on the bacterial cell membrane where the cell lysis occurs by the
electrostatic interactions between Cruzioseptin CC-17 with the different mole-
cules of the cell membrane.
INTRODUCCIÓN
La resistencia antimicrobiana se ha
convertido en uno de los problemas
de mayor importancia en el campo
de la salud pública. Los datos propor-
cionados por Centros para el Control
y la Prevención de Enfermedades
(CDC por sus siglas en inglés) son un
reflejo claro de esta problemática
pues se considera que cada año en
los Estados Unidos al menos 2,8 mi-
llones de personas contraen una in-
fección resistente a los antibióticos
mientras que más de 35000 personas
mueren (CDC, 2020). Este es un re-
sultado de la constante evolución bio-
lógica sumada al uso inadecuado de
antibióticos que ha desencadenado
una serie de cambios a nivel genético
en los diversos microor ganismos y
por ende el aumento de las tasas de
resistencia antimicrobiana (Lewies,
Du Plessis & Wentzel, 2019).
Dado que la efectividad de los anti-
bióticos convencionales se ha visto
severamente mermada (Lei et al.,
2019), la comunidad científica ha
centrado su interés en el estudio de
compuestos bioactivos tales como los
péptidos antimicrobianos (AMP), que
representan a las moléculas orgáni-
cas que forman parte del sistema de
la respuesta inmune innata de una
amplia gama de organismos como
anfibios, insectos, hongos, moluscos,
artrópodos, vertebrados y plantas
(Wang, 2020). Los AMP se encuen-
tran formados por cadenas de entre 8
a 45 aminoácidos los cuales no úni-
camente se destacan por presentar un
amplio espectro de actividad antimi-
crobiana y por proporcionar protec-
ción contra bacterias, hongos, pará-
sitos y virus (Datta & Roy, 2020), sino
que también tienen un rol importante
en la inhibición de células cancerí-
genas (Zhang, Yang & Ericsson,
2019).
Además, los péptidos antimicrobia-
nos se caracterizan por presentar una
carga neta que oscila entre +1 y +9
junto con propiedades catiónicas, hi-
drofóbicas y anfipáticas cuyo estudio
es sumamente importante, ya que
son los factores determinantes en su
actividad frente a los distintos mi-
croorganismos patógenos (Koehbach
& Craik, 2019). Se debe resaltar que
estos compuestos pueden presentar
estructuras primarias, secundarias y
terciarias muy diversas pero pueden
clasificarse en cuatro clases principa-
les: los péptidos que presentan una
estructura secundaria lineal α-helicoi-
dal; aquellos que presentan estructu-
ras lineales extendidas, es decir que
se encuentran desprovistas de ele-
mentos α o β pero que son ricas en
aminoácidos como la glicina, argi-
nina, triptófano o prolina (Koehbach
& Craik, 2019); los péptidos cuya es-
tructura pertenece a una lámina β que
es estable gracias a la presencia de
uno o varios enlaces disulfuro; y final-
mente se encuentran los péptidos que
presentan una estructura mixta con-
formada por una región α y una re-
gión β (Lee, Hall & Aguilar, 2015).
Los modelos propuestos para el me-
canismo de acción de los AMPs se
extienden desde la formación clásica
de poros (Raheem & Straus, 2019),
hasta aquellos que involucran la ac-
ción de fuerzas electrostáticas (De
Paula & Valente, 2018), sin embargo,
estos se pueden clasificar en dos
grandes grupos en donde se encuen-
tran mecanismos centrados en el ata-
que directo a la membrana y aquellos
que involucran funciones de inmuno-
modulación (Kumar, Kizhakkedathu
& Straus, 2018).
Muchos péptidos con propiedades
antimicrobianas han sido aislados a
partir de anfibios pues estos se carac-
terizan por poseer gándulas granula-
res (Varga, Bui-Marinos & Katzen-
back, 2019), las cuales, además de
ser las encargadas de mantener el
equilibrio iónico, son las responsa-
bles de proteger a estas especies con-
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tra la abrasión y agentes patógenos,
al ser propulsoras de la producción
de compuestos biológicamente acti-
vos que pueden llegar a presentar
propiedades fungicidas y bactericidas
(Demori et al., 2019).
En este sentido, las Cruzioseptinas
(CZS) son una nueva familia de pép-
tidos, extraídas a partir del exudado
de la rana, Cruziohyla calcarifer per-
tenecientes a la familia Phyllomedu-
sinae. Actualmente, se han reportado
alrededor de 14 Cruzioseptinas, que
se caracterizan por estar compuestas
por una cadena peptídica de entre 20
a 32 aminoácidos y por poseer una
secuencia N-terminal única compar-
tida. Asimismo, los distintos estudios
microbiológicos realizados demues-
tran que presentan un amplio espec-
tro de actividad antimicrobiana frente
a patógenos como el Staphylococcus
aureus y la levadura Candida albicans
y en menor medida frente a Escheri-
chia coli (Proaño-Bolaños et al.,
2016).
En el presente estudio, se emplean
distintos métodos computacionales
para caracterizar a la Cruzioseptina
CC-17 con respecto a sus propieda-
des fisicoquímicas y estructura se-
cundaria, así como también se
analiza el mecanismo de acción con
base en los resultados obtenidos me-
diante técnicas de acoplamiento mo-
lecular con enzimas inhibitorias de
patógenos y moléculas presentes en
la membrana celular bacteriana.
MATERIALES Y MÉTODOS
Para llevar a cabo el estudio compu-
tacional de la Cruzioseptina CC-17
se emplearon distintos recursos com-
putacionales como servidores web
(Pep Calc y Biosyn), bases de datos
(Protein Data Bank), herramientas de
visualización molecular (Pymol y Au-
todock Tools), softwares especializa-
dos en cálculos mecano cuánticos
(Gaussian 09) y herramientas enfoca-
das en el acoplamiento molecular
(Autodock Vina), con los cuales se
logró caracterizar el péptido en fun-
ción de sus propiedades fisicoquími-
cas y en base a su interacción con
una serie de moléculas presentes en
la membrana celular bacteriana.
Los servidores web Pep Calc (Lear &
Cobb, 2016) y Biosyn (Bio-Synthesis,
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2010) fueron usados para la predic-
ción de propiedades fisicoquímicas
tales como la carga neta, el punto
isoeléctrico, flexibilidad, probabili-
dad de superficie y composición de
la secuencia de aminoácidos.
La predicción de la estructura secun-
daria se realizó empleando los servi-
dores web Predict Protein (Yachdav &
Rost, 2013) y JPred 4 (Drozdetskiy,
Cole & Procter, 2015) con lo cual se
determinó las regiones alfa helicoida-
les y giros beta presentes en el pép-
tido.
El modelamiento computacional de
la estructura de la Cruzioseptina CC-
17 se realizó por medio del software
Pymol (Schrödinger, 2017) mientras
que la optimización de cada una de
las estructuras tridimensionales co-
rrespondientes al péptido y a las mo-
léculas presentes en la membrana
celular bacteriana fue realizada me-
diante el software Gaussian09 (Frisch
et al., 2016) haciendo uso del mé-
todo híbrido ONIOM en dos niveles
HF/3-21G//HF/6-31G.
Por último, se efectuó el estudio de
acoplamiento molecular, para lo cual
se seleccionaron dos enzimas pre-
sentes por cada patógeno de interés
y cuyas estructuras tridimensionales
fueron obtenidas a partir de la base
de datos RCSB Protein Data Bank
(Berman et al., 2002). Con la ayuda
del software Autodock Tools (Morris
et al., 2009) se crearon los archivos
de entrada para posteriormente eje-
cutar los cálculos en AutoDock VINA
(Trott & Olson, 2010), con lo cual se
obtuvo los valores de afinidad entre
el péptido con una serie de enzimas
asociadas a los patógenos de interés
y con moléculas presentes en la
membrana celular bacteriana.
RESULTADOS
A partir de la secuencia de aminoá-
cidos que conforman la Cruziosep-
tina CC-17 obtenida previamente por
el Laboratorio de Biología Molecular
y Bioquímica de la Universidad Re-
gional Amazónica IKIAM mediante
técnicas de clonación molecular y
secuenciamiento por espectrometría
de masas en tándem se llevó a cabo
la parte inicial del estudio computa-
cional del péptido que engloba la
predicción de propiedades fisicoquí-
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micas las cuales se presentan en la
Tabla 1. Por otra parte, la Tabla 2 pre-
senta la nomenclatura de los distintos
aminoácidos que conforman la se-
cuencia del péptido.
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas de la Cruzioseptina CC-17
Parámetro Cruzioseptina CC-17
Secuencia de aminoácidos GFLDVVKGVGKAALGAVTHLINQ-NH
2
Longitud 23
Peso molecular (Unidades) 2307,69
Punto isoeléctrico 8,6
Formula C
105
H
175
N
29
O
29
Número de átomos 338
Aminoácidos de carga negativa 1
Aminoácidos de carga positiva 2
Carga 3,1 (básica)
Hidrofobicidad 0,492
Momento hidrofóbico 0,429
Neutral: 30,43 %
Composición de la secuencia en porcentaje Básica: 13,04%
Ácida: 4,35%
Hidrofóbica: 52,17%
Tabla 2. Nomenclatura de aminoácidos que forman parte
de la estructura de la Cruzioseptina CC-17
Aminoácido Código de tres letras Código de una letra
Glicina Gly G
Fenilalanina Phe F
Leucina Leu L
Ácido aspártico Asp D
Valina Val V
Lisina Lys K
Alanina Ala A
Treonina Thr T
Histidina His H
Isoleucina Ile I
Asparagina Asn N
Glutamina Glu Q
Se puede notar que el péptido pre-
senta una carga neta de +3,1 así
como también que en la cadena pep-
tídica se encuentra presente un ami-
noácido de carga negativa y dos
aminoácidos de carga positiva. Adi-
cionalmente, se evidencia que la se-
cuencia correspondiente a la
Cruzioseptina CC-17 es en su mayo-
ría hidrofóbica.
En la Figura 1 expuesta a continua-
ción se observa el gráfico correspon-
diente a la probabilidad de superficie
en la cual se aprecia que las ventanas
de aminoácidos 1 y 11 son aquellas
que tienen la mayor probabilidad de
estar en la superficie del péptido, por
lo que son las que tienden a interac-
ciones con otras moléculas.
Adicionalmente, al estudiar la flexi-
bilidad del péptido, se observa que
esta presenta un valor que oscila
entre 0,92 y 1,02 y su punto máximo
corresponde a la posición 12 de la
ventana de aminoácidos.
Figura 1. Propiedades fisicoquímicas
de la Cruzioseptina CC-17
a. Probabilidad de superficie
b. Flexibilidad del péptido en función
de la secuencia de aminoácidos
(Bio-Synthesis, 2010)
En la Tabla 3 se muestran los resulta-
dos de la predicción de la estructura
secundaria del péptido realizada me-
diante distintas herramientas web,
cuyos resultados demuestran que en
la Cruzioseptina CC-17 predomina la
estructura alfa helicoidal y además se
evidencia la presencia de regiones
con giros beta tanto al inicio como al
final de la cadena de aminoácidos
que compone al péptido.
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Con base en los resultados de la pre-
dicción de la estructura secundaria
de la Cruzioseptina CC-17, el pép-
tido fue modelado y una vez obte-
nida la estructura tridimensional se
llevó a cabo la optimización geomé-
trica y minimización energética, con
lo que se obtuvo la conformación
más estable del péptido que se mues-
tra en la Figura 2. En este contexto, se
debe resaltar que la estructura opti-
mizada concuerda con las prediccio-
nes realizadas previamente, pues se
encuentra conformada por una re-
gión alfa helicoidal mayoritaria.
Tabla 3. Estructura secundaria de la Cruzioseptina CC-17
predicha mediante JPred4 y Predict Protein
Figura 2. Estructura tridimensional de la Cruzioseptina CC-17
optimizada mediante el método ONIOM HF/3-21G//HF/6-31G
Asimismo, se llevó a cabo el estudio
de acoplamiento molecular (Doc-
king), en donde se analizó el valor de
afinidad del péptido con distintas en-
zimas presentes en la membrana ce-
lular de los patógenos de interés, los
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cuales fueron comparados con los
puntajes de afinidad de los inhibido-
res conocidos. Se observa que el pép-
tido presenta mayor afinidad con la
Proteína de unión de Penicilina Trans-
glicosidada 1b, la cual es una enzima
presente en la membrana celular de
Escherichia coli y con la Hidrolasa
AmiA presente en Staphylococcus au-
reus (Tabla 4).
Cabe resaltar que en todos los casos
la afinidad del inhibidor es mayor
que la del péptido, sin embargo, se
considera que el puntaje obtenido
durante el acoplamiento al hacer re-
ferencia al valor predicho de la ener-
gía libre de la unión enzima-ligando
no permite determinar con certeza el
grado de afinidad entre estos dos
compuestos, sino que más bien per-
mite clasificar entre ligandos activos
e inactivos (Aguayo-Ortiz & Fernán-
dez-de Gortari, 2018).
Tabla 4. Valores de afinidad de la Cruzioseptina CC-17
con distintas enzimas presentes en la membrana celular de
Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Candida albicans
Puntaje de afinidad
Inhibidor
(kcal/mol)
Microorganismo Enzima
conocido
Staphylococcus
Proteína de unión de Penicilina g-Acil 2A Ceftobiprol -9,5 -5,5
aureus
Hidrolasa AmiA
Muramil
-7,1 -5,9
tetrapéptido
ADN girasa B ADP -10,4 -5,1
Escherichia coli Proteína de unión de Penicilina
Moenomicina -7,3 -6,3
Transglicosidada 1b
Candida albicans
Exo-B-(1,3)-glucaneasa Castanospermina -7,0 -5,6
Proteasa aspártica secretada A70
*
-7,7 -5,9
*A70: N-etil-N-[(4-metilpiperazin-1-yl) carbonil]-D-fenilalanil-N-[(1S,2S,4R)-4-(butilcarbamoil)-1-(ciclohexilmetil)-2-hi-
droxi-5-metilhexil]-L-norleucinamida
Inhibidor Cruzioseptina
conocido CC–17
Para realizar un estudio más profun -
do, se realizó el acoplamiento mole-
cular entre la Cruzioseptina CC-17 y
once moléculas presentes en la mem-
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brana celular de los tres microorga-
nismos estudiados. Los resultados se
encuentran detallados en la Tabla 4
en donde se evidencia que los valo-
res de afinidad son variables, pues
oscilan entre -2,0 y -3,8 kcal/mol, lo
cual se debe en gran medida a la di-
ferencia de tamaño y distribución de
cargas en cada una de las moléculas
presentes en la membrana bacte-
riana.
Tabla 5. Valores de afinidad de la
Cruzioseptina CC-17 con distintas enzimas
presentes en la membrana celular de
Staphylococcus aureus, Escherichia coli
y Candida albicans
Afinidad
(kcal/mol)
Moléculas de la membrana celular Cruzioseptina
CC-17
Ácido teicoico -2,8
Beta 1-3 glucano -3,2
Fosfatidiletanolamina -2,3
Glicofosfolípidos
Fosfomanolípido
-3,8
Glicofosfolípido GPLs -2,7
Lisil-fosfatidilglicerol -2,0
Ácido mirístico -2,8
Ácido oleico -2,8
Ácido palmítico -2,6
Ácido palmitoleico -2,8
Fosfatidilglicerol -2,3
DISCUSIÓN
Las Cruzioseptinas caracterizadas a
partir de la secreción cutánea de la
rana Cruziohyla Calcarifer, son una
familia de péptidos muy diversa que
se caracterizan por poseer una se-
cuencia N-terminal única compar-
tida. En este sentido, las propiedades
fisicoquímicas expuestas en la Tabla 1
permiten clasificar a la Cruzioseptina
CC-17 como un péptido antimicro-
biano conformado por 23 aminoáci-
dos y que destaca por ser catiónico y
básico. Además, posee un C-terminal
amida que le otorga una carga posi-
tiva adicional al péptido atribuyén-
dose así una carga neta de +3,1, la
cual es fundamental en la selectivi-
dad del péptido (Bahar & Ren, 2013),
pues al estar relacionada con el nú-
mero de grupos ionizables del pép-
tido se constituye como un factor que
favorece la interacción electrostática
que es la principal fuerza de atrac-
ción que motiva el primer contacto
entre el péptido y la membrana bac-
teriana (Jindal et al., 2014).
Al analizar la conformación de la ca-
dena peptídica se evidencia la pre-
sencia de lisina e histidina, los cuales
conceden el carácter básico al pép-
tido y constituyen el 13,04 % de la
secuencia de aminoácidos, asi-
mismo, se observa la presencia de
ácido aspártico el cual además de
contribuir con una carga negativa
constituye el 4,35 % de la secuencia
peptídica.
La Tabla 1 también permite eviden-
ciar que un 52,17 % corresponde a
aminoácidos hidrofóbicos lo que se
justifica debido a la presencia mayo-
ritaria de alanina y valina junto con
un menor número de residuos de leu-
cina, isoleucina y fenilalanina, los
cuales gobiernan la capacidad del
péptido para ingresar a la bicapa lipí-
dica de la membrana microbiana. Fi-
nalmente, el 30,43 % restante de la
secuencia corresponde a aminoáci-
dos neutrales lo cual está determi-
nado por la presencia de glicina,
treonina, asparagina y glutamina que
son aminoácidos conocidos por apor-
tar grupos funcionales polares que
tienden a la formación de puentes de
hidrógeno (Garret & Grishman, 2017;
Li, Vorobyov, & Allen, 2013).
Como parte de la caracterización del
péptido se analizó la probabilidad de
superficie, en donde se nota que la
ventana 1 y 11 son las que presentan
la tendencia a estar más expuestas
(Bio-Synthesis, 2010). Tanto la ven-
tana 1 como la 11 se encuentran for-
madas principalmente por aminoáci-
dos hidrofóbicos (alanina, leucina,
glicina y valina) los cuales tienden a
estabilizar la cadena y por ende no
sufren cambios drásticos al momento
del plegamiento del péptido y hacen
efectiva la inserción en el núcleo hi-
drofóbico de la membrana celular
bacteriana lo que aumenta el desor-
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den de los fosfolípidos y causa una
disminución en su función protectora
(Cantor et al., 2019).
En cuanto a la flexibilidad del péptido
se determinó que la región compren-
dida por la posición de ventanas 10 y
14 corresponden a la zona más flexi-
ble mientras que la posición 6 es la
más rígida lo cual se debe a que al
estar conformada por la cadena
VKGVGK
*
en donde existe igual nú-
mero de aminoácidos básicos con
carga positiva, neutros e hidrofóbicos
se tiene una conformación más esta-
ble y por ende con menor tendencia
a ser desestabilizada (Rončević et al.,
2018).
Con base en los resultados de flexibi-
lidad del péptido, se puede determi-
nar que la zona central de la
Cruzioseptina CC-17 es la región más
flexible, lo cual es poco común para
este tipo de moléculas, en donde ge-
neralmente las regiones más flexibles
son los extremos de la cadena peptí-
dica, sin embargo, esta característica
sugiere la existencia de movimientos
rotacionales de las cadenas laterales
del péptido al momento de la interac-
ción con proteínas o moléculas de la
membrana celular bacteriana, lo que
se relaciona con una mejor inserción
del péptido en el bolsillo enzimático
(Babii et al., 2017).
Al analizar los resultados de las pre-
dicciones de la estructura secundaria
del péptido presentados en la Tabla
2, se determinó que este se encuentra
formado en su mayoría por una re-
gión alfa helicoidal, la cual repre-
senta entre el 69,6 y el 82,6 % de la
estructura total, mientras que el por-
centaje restante corresponde a las
zonas extremas, en donde existen re-
siduos que adquieren una conforma-
ción correspondiente a giros beta, lo
cual se relaciona con la formación de
puentes de hidrógeno entre el primer
y el cuarto aminoácido de la cadena
peptídica (Borah, Deb & Chakra-
borty). La predominancia de la es-
tructura alfa helicoidal se debe a la
presencia de aminoácidos neutrales
e hidrofóbicos, los cuales tienden a
la formación de puentes de hidró-
geno entre los átomos de oxígeno del
grupo carbonilo de un aminoácido y
el átomo de hidrógeno del grupo
amino de otro aminoácido, obte-
niendo así una configuración estable
(Arakawa & DeForest, 2017).
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Al contrastar las predicciones realiza-
das con la estructura optimizada de
la Cruzioseptina CC-17 (Figura 2), se
evidencia la existencia de una gran
similitud, pues la gran mayoría de
aminoácidos adquieren la conforma-
ción alfa helicoidal, siendo sola-
mente los dos primeros (-GF)
*
y los
dos últimos (-NQ)
*
residuos de la ca-
dena peptídica, los que sufren una
desestabilización y en lugar de ad-
quirir una conformación relacionada
con los giros beta se constituyen
como colas randómicas que se carac-
terizan por ser estructuras muy flexi-
bles que facilitarán el ingreso del
péptido al bolsillo enzimático.
En cuanto a los mecanismos de ac-
ción de los péptidos antimicrobianos,
existen una gran variedad de teorías,
sin embargo, dentro de estas se pue-
den distinguir dos grupos que son los
mecanismos de modulación inmuno-
lógica y aquellos de ataque directo a
la membrana celular bacteriana.
(Kumar et al., 2018).
En este sentido, se llevó a cabo el es-
tudio de acoplamiento molecular de
la Cruzioseptina CC-17 con una serie
de enzimas, para conocer si el pép-
tido ejerce un mecanismo de ataque
indirecto basado en la inhibición en-
zimática mientras que el acopla-
miento con moléculas presentes en la
membrana celular bacteriana se re-
alizó con el fin de estudiar un meca-
nismo de acción enfocado en el
ataque directo a la membrana.
Los resultados mostrados en la Tabla
3 demuestran que la Cruzioseptina
CC-17 tiene una mayor afinidad con
la Hidrolasa AmiA, la proteína de
unión de Penicilina Transglicosidada
1b y la proteasa aspártica secretada,
sin embargo, se evidencia que, en
todos los casos, el péptido tiene
menos afinidad que los inhibidores.
* Véase nomenclatura en Tabla 2.
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Cruziohyla calcarifer
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Figura 3. Interacción de la Cruzioseptina CC-17 (azul) con
a). Proteasa aspártica secretada (amarillo)
b). Proteína Transglicosidada 1b (verde) c). Hidrolasa AmiA (gris)
a) b) c)
En la Figura 3 inciso a), se observa
que la Cruzioseptina CC-17 se aco-
pla a la forma del bolsillo enzimá-
tico, lo cual se debe en mayor
medida a los cambios rotacionales de
las cadenas laterales de la estructura.
Además, se evidencia que la parte
central es la que logra una mayor in-
teracción con el sitio activo enzimá-
tico, sin embargo, el péptido no logra
la inhibición dado que la Proteasa
Aspártica forma parte de las enzimas
hidrolasas cuya función catalítica es
la hidrólisis de las cadenas peptídicas
(Dunn, 2013). En el inciso b) se evi-
dencia una buena interacción super-
ficial entre el péptido y la enzima
debido a la buena exposición del
bolsillo enzimático, sin embargo, el
péptido no logra cubrir por completo
el sitio activo lo cual se justifica dado
que la Cruzioseptina CC-17 presenta
un tamaño reducido en comparación
con el inhibidor conocido (Moeno-
micina). Por último, en el inciso c) se
observa una interacción superficial
que está relacionada con la existen-
cia fuerzas electrostáticas entre el
péptido y el sitio activo, sin embargo,
se considera que el péptido no in-
gresa al bolsillo enzimático debido a
la marcada diferencia entre la longi-
tud de cadena del inhibidor cono-
cido (conformado por 4 aminoáci-
dos) y la de la Cruzioseptina CC-17
(Cuesta et al., 2019).
Figura 4. Interacción de la Cruzioseptina
CC-17 (azul) con la enzima ADN girasa
(naranja)
En el caso del acoplamiento con la
ADN Girasa (Figura 4) se nota que la
Cruzioseptina CC-17 tiende a inte-
raccionar con el bolsillo enzimático,
siendo los residuos de lisina cargados
positivamente los que mantienen una
interacción marcada en el sitio ac-
tivo. Cabe aclarar que existe una di-
ferencia muy marcada entre el valor
de afinidad del péptido y el ADP, la
que se debe en su mayoría a la dife-
rencia de carga entre el inhibidor co-
nocido que presenta carga negativa y
el péptido con carga +2 (Cuesta et
al., 2019).
Figura 5. Interacción de la Cruzioseptina
CC-17 (azul) con la enzima Exo-B-(1,3)-
glucanasa (rosa)
En la Figura 5 se observa que en el
acoplamiento de la enzima Exo-B-
(1,3)-glucanasa con la Cruzioseptina
CC-17, ésta ingresa al sitio activo de-
bido a que el bolsillo enzimático es
lo suficientemente amplio y se con-
sidera que el mecanismo de inhibi-
ción en este caso se logra ya que el
péptido recubre el sitio activo y por
ende la enzima no es capaz de hidro-
lizar glucanos, lo que interrumpe la
provisión de energía a la célula cau-
sando así un desbalance en la misma
que al final desencadena en un pro-
ceso de lisis celular (Ramos & Mal-
cata, 2011).
Por otra parte, cabe destacar que en
el acoplamiento con la Proteína de
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unión de Penicilina G-acil 2 no existe
inhibición debido a que el péptido
presenta un mayor número de áto-
mos en comparación con el inhibidor
lo que dificulta la entrada de la Cru-
zioseptina CC-17 en el sitio activo,
además existe una diferencia de car-
gas significativas pues la Cruziosep-
tina CC-17 a pH 7 presenta una carga
de +1,1 mientras que la carga del in-
hibidor presenta un valor de -1.
Por último, al analizar los resultados
obtenidos después del acoplamiento
con distintas moléculas presentes en
la membrana celular bacteriana, se
evidencia que los valores de afinidad
son relativamente bajos y oscilan
entre -2,0 y -3,8 kcal/mol, lo que de-
nota la existencia de una interacción
leve entre ambas moléculas. Hay que
considerar que la monocapa lipídica
que constituye superficialmente a la
membrana celular bacteriana se en-
cuentra formada por compuestos que
se caracterizan por poseer lípidos
con grupos cargados, entre los que se
destacan glicofosfolípidos junto con
fosfoaminolípidos (Strahl & Errington,
2017) y presentan una buena interac-
ción con el péptido debido a que este
presenta una carga neta positiva y
por ende, son capaces de generar
una ruptura de la pared celular,
siendo este el mecanismo de acción
más viable.
Además, la hidrofobicidad de la ca-
dena peptídica es un factor clave
pues esta dictamina hasta qué punto
el péptido será soluble en agua y po-
drán dividirse en la bicapa lipídica de
la membrana, es por esto que se con-
sidera que la Cruzioseptina CC-17 al
poseer una composición mayor-
mente hidrofóbica, tendrá la capaci-
dad de generar una ruptura de la
membrana bacteriana externa conti-
nuando con un ataque a la mem-
brada interna (Kumar et al., 2018).
CONCLUSIÓN
Con base en el modelamiento com-
putacional de la Cruzioseptina CC-
17 extraída a partir del exudado de la
rana Cruziohyla calcarifer, se deter-
minó que sus propiedades fisicoquí-
micas concuerdan con la de com-
puestos bioactivos previamente estu-
diados pues presenta una cadena
peptídica conformado por 23 ami-
noácidos es de carácter básico, pues
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presenta una carga de +3,1 así como
también se destaca por poseer un
punto isoeléctrico de 8,6. Adicional-
mente, se estableció que la interac-
ción entre el péptido, las enzimas y
las moléculas de la membrana celu-
lar bacteriana se encuentra determi-
nada por la presencia de un 52 % de
aminoácidos hidrofóbicos junto con
la presencia de aminoácidos básicos,
lo cual también permite caracterizar
a este compuesto bioactivo como un
péptido antimicrobiano catiónico.
Por otra parte, los estudios de acopla-
miento molecular sugieren que un
mecanismo de acción relacionado
con la inhibición enzimática no es
viable, debido a factores relaciona-
dos principalmente con el tamaño
del péptido y su carga, por esto se
considera que un mecanismo de ac-
ción aceptable es el centrado en el
ataque a la membrana dentro del
cual intervienen atracciones electros-
táticas que tienen lugar entre las re-
giones del péptido con carga positiva
y los componentes de la membrana
que presentan cargas negativas de-
bido a la presencia de grupos fosfa-
tos, lo que sugiere que el péptido
podría ser usado potencialmente en
combinación con antibióticos para
aumentar tanto su efectividad como
su selectividad.
Este trabajo tuvo financiamiento de la
Pontificia Universidad Católica del
Ecuador a través del proyecto
QINV0180-IINV529020200.
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