MODELAMIENTO MOLECULAR DE LA CRUZIOSEPTINA CC-16
EXTRAÍDA DE LA RANA
Cruziohyla calcarifer
Morales et. al., 135–159
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MODELAMIENTO MOLECULAR
DE LA CRUZIOSEPTINA CC-16
EXTRAÍDA DE LA RANA Cruziohyla calcarifer
MOLECULAR MODELING OF CRUZIOSEPTIN CC-16
EXTRACTED FROM THE FROG Cruziohyla calcarifer
Felipe Morales P.
1
, Sebastián Cuesta H.
1
, Carolina Proaño-Bolaños
2,3
& Lorena Meneses O.
1
*
Recibido: 30 de abril 2021 / Aceptado: 1 de julio 2021
10.26807/ia.v9i2.215
Palabras clave: Acoplamiento molecular, Cruzioseptinas, Cruziohyla
calcarifer, modelamiento molecular, péptidos antimicrobianos.
Keywords: Antimicrobial peptides, antimicrobial peptides, Cruzioseptins,
Cruziohyla calcarifer, Molecular docking.
RESUMEN
El creciente desarrollo de resistencia a antibióticos por parte de mundo micro-
biano es un problema cada vez mayor y en respuesta nuevas moléculas con
1 Pontificia Universidad Católica del Ecuador, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Escuela de
Ciencias Químicas, Laboratorio de Química Computacional, Quito, Ecuador (ffmmjjpp@hotmail.es;
sebastian_cuesta@yahoo.com; *correspondencia: lmmeneses@puce.edu.ec)
2 Universidad Regional Amazónica IKIAM, Grupo de Descubrimiento de Biomoléculas, Laboratorio de
Biología Molecular y Bioquímica, Tena, Ecuador (carolina.proano@ikiam.edu.ec)
3 Queen´s University Belfast, School of Pharmacy, Natural Drug Discovery Group, Belfast, UK (caro-
lina.proano@ikiam.edu.ec)
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potencial antimicrobiano están siendo estudiadas, entre ellas los péptidos an-
timicrobianos como las Cruzioseptinas. Este trabajo presenta un estudio com-
putacional preliminar de la Cruzioseptina CC-16 extraída del exudado de la
piel de la rana Cruziohyla calcarifer. Con base en la secuencia de aminoácidos
del péptido se llevaron a cabo diferentes estudios computacionales, entre ellos,
la predicción de las propiedades fisicoquímicas y la estructura secundaria. Ade-
más de esto se efectuó el acoplamiento molecular de la Cruzioseptina CC-16
con diferentes enzimas de importancia biológica para microrganismos como
Escherechia coli, Staphylococcus aureus y Candida albicans, y con moléculas
presentes en la membrana celular bacteriana. Los resultados mostraron que la
Cruzioseptina CC-16 es un péptido de 23 residuos de largo con una confor-
mación alfa helicoidal predominante, un punto isoeléctrico de 10,73, una carga
de +3 de carácter básica y una carga neta a pH 7 de +3,1, además de tener
más del 50 % de su estructura conformada por aminoácidos hidrofóbicos, cla-
sificando como un péptido antimicrobiano catiónico. Los estudios preliminares
de acoplamiento molecular muestran que un mecanismo de acción basado en
inhibición enzimática no es posible, debido principalmente al tamaño del pép-
tido, mientras que un mecanismo con base en un ataque concentrado en la
membrana microbiana puede ser viable, debido a las interacciones electrostá-
ticas de la Cruzioseptina CC-16 con diferentes componentes de la membrana.
ABSTRACT
The increasing development of resistance to antibiotics by the microbial world
is a growing problem and in response new molecules with antimicrobial po-
tential are being studied, among them antimicrobial peptides such as Cruzio-
septins. This work presents a preliminary computational study of Cruzioseptin
CC-16 extracted from exudate from the skin of the frog Cruziohyla calcarifer.
Based on the amino acid sequence of the peptide, different computational stu-
dies were carried out, including the prediction of its physicochemical properties
and its secondary structure. In addition to this, a molecular docking study of
Cruzioseptin CC-16 was carried out with different enzymes of biological im-
portance for microorganisms such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus
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and Candida albicans, and with molecules present in the bacterial cell mem-
brane. The results showed that Cruzioseptin CC-16 is a 23 residues long peptide
with a predominant alpha helical conformation, an isoelectric point of 10.73,
a basic charge of +3 and a net charge at pH 7 of +3.1, in addition of having
more than 50 % of its structure made up of hydrophobic amino acids, fitting
the definition of a cationic antimicrobial peptide. Preliminary molecular doc-
king studies show that a mechanism of action based on enzyme inhibition is
not possible mainly due to the size of the peptide, while a mechanism based
on a concentrated attack on the microbial membrane may be viable due to the
electrostatic interactions of the Cruizoseptin CC-16 with different components
of the membrane.
INTRODUCCIÓN
La constante evolución de los seres
vivos ha significado el desarrollo de
nuevos mecanismos de defensa por
parte de estos para perpetuar su exis-
tencia en este planeta (Demori et al.,
2019; Martinez, 2014; Rhouma et al.,
2016; Roca et al., 2015; Walsh &
Wencewicz, 2014). Los microorga-
nismos patógenos no se han quedado
atrás, y cada día desarrollan una
mayor resistencia contra los antibió-
ticos utilizados en su contra, lle-
gando a tal punto que las bacterias
multirresistentes se han convertido en
un problema global de salud (Can-
dido et al., 2019; Martinez, 2014; Pe-
ters et al., 2010; Roca et al., 2015;
Walsh & Wencewicz, 2014). En res-
puesta, la comunidad científica está
poniendo grandes esfuerzos en la
búsqueda y desarrollo de nuevos
medicamentos mucho más potentes
y eficaces, pero también menos peli-
grosos para el ser humano (Bastos et
al., 2018; Cui et al., 2017; Peters et
al., 2010; Walsh & Wencewicz,
2014).
El desarrollo de nuevos antibióticos
actualmente está centrado en dos lí-
neas de investigación paralelas, la
identificación en la naturaleza de
moléculas con potencial antimicro-
biano y el desarrollo de moléculas
sintéticas con capacidad antibiótica
(Haney et al., 2017; Roca et al.,
2015; Walsh & Wencewicz, 2014).
Uno de los grupos de moléculas de
origen natural que está llamando la
atención debido a su constante pre-
sencia en el sistema de inmunidad
innata de varios seres vivos son los
péptidos antimicrobianos o AMPs por
sus siglas en inglés (Ciumac et al.,
2019; Haney et al., 2017; Peters et
al., 2010).
Los AMPs son moléculas pequeñas
de carácter anfipático con carga po-
sitiva de entre +2 y +13, constituidas
por una cadena de entre seis y cien
aminoácidos (Haney et al., 2017;
Kumar et al., 2018; Latendorf et al.,
2019). Con base en su estructura se-
cundaria, los AMPs pueden ser clasi-
ficados en cuatro grades grupos,
hoja-β, hélice-α, bucle y péptidos ex-
tendidos. Su estructura secundaria
suele presentarse de manera estable
en un medio predominante de fosfo-
lípidos y tienden a perder su confor-
mación en medios acuosos (Ciumac
et al., 2019; Haney et al., 2017; Hoa-
gland et al., 2001; Peters et al., 2010;
Rydberg et al., 2012; Walsh & Wen-
cewicz, 2014). La gran mayoría de
estas moléculas son de carácter ca-
tiónico con más del 50 % de los ami-
noácidos que los conforman de
carácter hidrofóbico, además de po-
seer al menos dos aminoácidos bási-
cos, como la lisina y la histidina, que
aportan con cargas positivas extras al
péptido (Ciumac et al., 2019, 2019;
Kim & Jin, 2019; Latendorf et al.,
2019; Proaño-Bolaños, 2016).
Se han reportado más de 5000 AMPs
con actividad contra diferentes orga-
nismos, mostrándose efectivos ante
bacterias, hongos, virus, parásitos e
incluso células cancerígenas (Bechin-
ger & Gorr, 2017; Ciumac et al.,
2019; Latendorf et al., 2019). Los me-
canismos de acción por los cuales los
AMPs trabajan aún se encuentran
bajo estudio, pero se ha llegado a
describir las posibles formas en las
que estas moléculas trabajan. Cabe
recalcar que la función in vivo de va-
rios AMPs no ha sido determinada,
pues han mostrado cumplir diferen-
tes funciones más allá de la de la pro-
tección contra organismos potencial-
mente peligrosos (Ciumac et al.,
2019; Gorr & Abdolhosseini, 2011;
Kumar et al., 2018; Kwon et al.,
2019).
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Los mecanismos de acción de los
AMPs se pueden dividir en dos gran-
des grupos, la modulación inmuno-
lógica y la muerte directa. La modu-
lación inmunológica se refiere a la
capacidad de los péptidos para cau-
sar respuestas inmunes como la acti-
vación y conglomeración de glóbulos
blancos, la estimulación de la angio-
génesis y la reducción de la inflama-
ción, lo que a la larga provocará la
muerte de células patógenas (Feng et
al. 2020; Gorr y Abdolhosseini 2011;
Kumar et al. 2018). Por otro lado, los
mecanismos por muerte directa se re-
fieren a la interacción del péptido con
diferentes moléculas presentes en la
zona exterior o interior de la célula
bacteriana (como enzimas y proteí-
nas), el ataque y apertura de la bicapa
lipídica bacteriana, y la disrupción de
los enlaces entre la membrana y dife-
rentes maquinarias moleculares (Be-
chinger & Gorr, 2017; Ciemny et al.,
2018; Ciumac et al., 2019; Kumar et
al., 2018; Li et al., 2017; Rudi et al.,
2010; Yasir et al., 2019).
La capa exterior de las bacterias
Gram positivas y Gram negativas
están compuestas principalmente por
ácidos teicoicos y lipopolisacáridos,
los cuales tienen una carga neta ne-
gativa, convirtiéndolos en blancos
para los AMPs catiónicos, debido a la
atracción electrostática. A diferencia
de las membranas bacterianas, las
membranas animales se conforman
por fosfolípidos iónicos híbridos tales
como la fosfatidilcolina, la esfingo-
mielina y otros componentes neutros
como el colesterol, siendo poco
atractivas para los AMPs catiónicos
(Bechinger & Gorr, 2017; Ciumac et
al., 2019; H et al., 2019; Kumar et al.,
2018; Li et al., 2017).
Existen varias fuentes de AMPs en la
naturaleza, entre ellas se encuentra la
piel de los anfibios. Las secreciones
de las glándulas granulares de estos
animales han demostrado ser una
mezcla compleja de varias moléculas
bioactivas, que resultan de una adap-
tación evolutiva debido a la exposi-
ción de estos animales a ambientes
hostiles donde abundan los microor-
ganismos patógenos (Conlon et al.,
2019; Demori et al., 2019; I et al.,
2018; Mingqiang et al., 2018). Estas
secreciones se encuentran compues-
tas principalmente por alcaloides, di-
versas moléculas antioxidantes,
péptidos, diferentes ácidos nucleicos,
esteroides y una gran variedad de
proteínas.
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Se han encontrado ya más de 100 fa-
milias de AMPs en más de 165 espe-
cies y 26 géneros, pero aún existen
ciertos géneros que se mantienen en
el anonimato, como el género Cru-
ziohyla donde sobresale la Cruziohy -
la calcarifer, localizada desde el
caribe hondureño hasta el noreste del
Ecuador (I et al., 2018; Mingqiang et
al., 2018; Proaño-Bolaños et al.,
2019). Esta rana posee una gran pro-
ximidad taxonómica con la familia
Agalychnis, bien conocida por su piel
rica en péptidos bioactivos. Dentro de
la piel de Cruziohyla calcarifer, se ha
encontrado una nueva familia de pép-
tidos con grandes propiedades antimi-
crobianas, las Cruzioseptinas (Lewin
etal., 2017; Proaño-Bolaños, 2016).
Las Cruzioseptinas han sido reciente-
mente descubiertas y han demos-
trado un gran poder antimicrobiano,
sin embargo, existen pocas investiga-
ciones dedicadas a comprender en
profundidad su accionar contra los
microorganismos patógenos, gene-
rando una creciente necesidad de es-
tudiarlas (Proaño-Bolaños, 2016).
Este trabajo tiene como objetivo apli-
car técnicas computacionales en la
Cruzioseptina CC-16 (CZS-16) ex-
traída del exudado de la rana Cru-
ziohyla calcarifer para determinar sus
propiedades fisicoquímicas y su es-
tructura secundaria, además de reali-
zar el acoplamiento molecular del
péptido con moléculas presentes en
la membrana celular bacteriana y va-
rias enzimas cruciales para la vida de
microorganismos como Escherichia
coli, Staphylococcus aureus y Can-
dida albicans.
MATERIALES Y MÉTODOS
En el presente trabajo se utilizó una
variedad de recursos como servidores
en línea, bases de datos, herramien-
tas web, sistemas de visualización
molecular y programas para simula-
ciones, cálculos y predicciones com-
putacionales.
La predicción de las propiedades fi-
sicoquímicas se realizó utilizando las
herramientas web BioSyn (Bio-Syn-
thesis, 2010), y PepCalc (Innovagen
AB, 2015) mientras que la predicción
de la estructura secundaria se llevó a
cabo mediante las herramientas web
Predict Protein (Yachdav & Rost,
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2013), JPred 4 (Drozdetskiy et al.,
2015) y BioSyn (Bio-Synthesis, 2010).
La estructura secundaria en tres di-
mensiones de CZS-16 fue modelada
con base en las predicciones usando
el programa PyMol (Schrödinger,
2017). Todas las estructuras resultan-
tes, incluyendo las moléculas presen-
tes en la membrana celular bacte-
riana, fueron optimizadas mediante
el método híbrido ONIOM en dos
niveles, HF/3-21G/ y HF/6-31G,
ambos integrados en el programa
Gaussian 09 (Frisch et al., 2009).
Para obtener más información acerca
del mecanismo de acción de CZS-16
se escogieron dos blancos biológicos
por cada patógeno estudiado. Sus es-
tructuras tridimensionales fueron ob-
tenidas de la biblioteca web RCSB
Protein Data Bank (Berman et al.,
2002). Posteriormente, los cálculos
del acoplamiento molecular del pép-
tido con los blancos biológicos y las
moléculas presentes en la membrana
celular bacteriana fueron preparados
utilizando el programa AutoDock
Tools (Morris et al., 2009), para final-
mente realizar los cálculos en el pro-
grama AutoDock VINA (Trott &
Olson, 2010) utilizando un espaciado
de 1A, la exhaustividad 8 y flexibili-
dad total de la cadena del ligando.
RESULTADOS
Previos estudios han demostrado la
actividad antimicrobiana de las Cru-
zioseptinas frente a diferentes agentes
patógenos (Proaño-Bolaños, 2016).
La Cruzioseptina CC-16 pertenece a
esta familia de péptidos por lo que se
llevó a cabo su estudio bajo diferen-
tes técnicas computacionales.
Tabla 1. Propiedades fisicoquímicas
de la CZS-16
Parámetro Cruzioseptina CC-16
Secuencia
GFLDVLKGVGKAALGAVTHLINQ-NH
2
Longitud 23
Peso molecular 2320,92
Punto isoeléctrico 10,73
Formula C
106
H
178
N
30
O
28
# de átomos 342
aa de carga negativa 1
aa de carga positiva 3
Carga +3 (básica)
Carga neta a pH 7 +3,1
% de aa neutrales 30,43
% de aa básicos 13,04
% de aa ácidos 4,35
% de aa hidrofóbicos 52,17
aa=aminoácidos
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La predicción de las propiedades fi-
sicoquímicas se muestra en la Tabla
1, donde se presentan la secuencia
de aminoácidos y la longitud, pará-
metros importantes, puesto que son
útiles para la determinación de la es-
tructura secundaria. Se puede obser-
var que el péptido posee 3
aminoácidos de carga positiva y 1 de
carga negativa además de una carga
de +3 de carácter básica, lo cual se
atribuye a su porcentaje mayoritario
de aminoácidos básicos y a la amida-
ción del C-terminal la cual aporta
una carga positiva extra, también se
observa que el péptido tiene una
carga neta a pH neutro de +3,1. De
igual manera se aprecia que este se
encuentra principalmente constitui-
dos por aminoácidos de carácter hi-
drofóbico.
Figura 1. Probabilidad de superficie del péptido de acuerdo con su secuen-
cia de aminoácidos
En la Figura 1 se puede apreciar las
regiones de la secuencia que tiene
mayor o menor probabilidad de que
se encuentren en la superficie del
péptido, donde un valor de 1,0 (que
nunca ocurrirá), significaría que la re-
gión contenida en la ventana cen-
trada alrededor de ese punto está de-
finitivamente expuesta en la superfi-
cie de la proteína y un valor de 0,0
(que tampoco ocurrirá nunca), signi-
fica que la región contenida en la
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ventana centrada alrededor de ese
punto definitivamente está enterrada
en el interior de la proteína. La Figura
1 muestra que las posiciones 7 y 17
de la ventana son las que tienen
mayor probabilidad de estar en la su-
perficie, pudiendo ser las más pro-
pensas a interacciones con otras
moléculas.
Figura 2. Flexibilidad del péptido de acuerdo con su secuencia de aminoácidos
La flexibilidad del péptido fue estu-
diada con el fin de determinar si esta
es lo suficientemente flexible para in-
teractuar de manera óptima con otras
moléculas. Dentro de la Figura 2 se
observa que la flexibilidad media del
péptido es 1,0 donde se predice que
regiones mayores a 1,0 son más fle-
xibles mientras que regiones menores
a 1,0 son menos flexibles, en compa-
ración con la flexibilidad media del
péptido. Se puede apreciar que la po-
sición 6 de la ventana es la que
mayor flexibilidad presenta.
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a.
b.
Figura 3. Estructura secundaria de CZS-16. a. Predicción obtenida por JPred
4. b. Predicción obtenida por Predictprotein
Las predicciones de la estructura se-
cundaria de la CZS-16 muestran una
conformación mayoritaria alfa-heli-
coidal con colas randómicas. Tanto la
predicción hecha con JPred 4 como
con Predictprotein muestran una
conformación con un alto nivel de
conservación de las propiedades quí-
micas de los aminoácidos, esto se
puede observar dentro de la Figura 3
inciso a. y b. donde el color rojo in-
tenso es un indicador de esta carac-
terística.
con el inhibidor
c
Figura 4. Estructura optimizada obtenida por el método químico cuántico
ONIOM HF/6-31G
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Por otro lado, la Figura 4 muestra que
la estructura optimizada presenta una
gran relación con las predicciones re-
alizadas ya que mantiene una estruc-
tura alfa helicoidal.
Tabla 2. Valores de afinidad entre la CZS-16
y las diferentes enzimas comparadas con sus inhibidores conocidos
Organismo Enzima
Inhibidor
Afinidad (kcal/mol)
conocido
Afinidad con el inhibidor
conocido(kcal/mol)
CZS-16
Proteína de unión
de Penicilina G-acil 2A Ceftobiprole -9,5 -6,0
S. aureus
(PDB:1MWT)
Hidrolasa AmiA, Muramil
(PDB:4KNL) etapéptido -7,1 -5,4
ADN Girasa B
(PDB:4PRV) ADP -10,4 -6,1
E. coli Proteína deunión
de Penicilina Moenomicina -7,3 -6,0
tranglicosilasa 1B
(PDB:3VMA)
Exo-B-(1,3)
-glucanasa Castanospermina -7,0 -5,2
C.
(PDB:1EQC)
albicans
Proteasa aspártica
secretada A70* -7,7 -6,1
(PDB:1EAG)
*A70: N-etil-N-[(4-metilpiperazin-1-yl)carbonil]-D-fenilalanil-N-[(1S,2S,4R)-4-(butilcarbamoil)-1-(ciclohexilmetil)-2-
hidroxi-5-metilhexil]-L-norleucinamida
Los resultados de los cálculos de aco-
plamiento molecular de la Cruzio-
septina CC-16 con diferentes enzi-
mas se muestra dentro de la Tabla 2.
En estos estudios se observa que el
péptido estudiado no muestra, en
ninguno de los casos, una mayor afi-
nidad con la enzima, en compara-
ción con su inhibidor conocido.
Los cálculos de acoplamiento mole-
cular también se realizaron con mo-
léculas presentes en la membrana
celular. Estos resultados se presentan
en la Tabla 3. Aquí se puede observar
que los valores de afinidad oscilan
entre -2,6 y -4,3 kcal/mol a excep-
ción del valor de afinidad obtenido
con la cardiolipina, que presenta un
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Tabla 3. Valores de acoplamiento
de la interacción entre la CZS-16
y las moléculas presentes
en la membrana celular
Moléculas de la
Afinidad
membrana celular
(kcal/mol)
CZS-16
Ácido Teicoico -3,2
beta 1-3 glucano -3,1
Cardiolipina 72,3
Fosfatidiletanolamina -3,0
Glicofosfolípidos
Fosfoaminolípido
-4,3
Glicofosfolipido GPLs -3,6
Lisil-Fosfatidilglicerol -3,1
Ácido mirístico -3,1
Ácido oleico -2,8
Ácido palmítico -2,8
Ácido palmitoleico -3,2
Fosfatidilglicerol -2,6
DISCUSIÓN
La predicción de las propiedades fi-
sicoquímicas de la CZS-16 (Tabla 1)
muestran que el péptido posee una
cadena corta de 23 aminoácidos,
donde sobresale la presencia de ami-
noácidos de carga positiva y de ca-
racterísticas básicas como la lisina y
la histidina, conformando el 13,04 %
del total de los residuos, y tan solo un
aminoácido de carga negativa y ca-
racterísticas acidas, el ácido aspár-
tico, lo que representa el 4,35 % del
total de residuos del péptido. La pre-
dominancia de los aminoácidos de
carga positiva es lo que le atribuye a
la CZS-16 su carga y punto isoeléc-
trico. El 30,43 % de aminoácidos
neutrales le confiere al péptido gru-
pos funcionales polares con capaci-
dad de formar puentes de hidrógeno,
mientras que el 52,17 % de aminoá-
cidos hidrofóbicos otorgan estabili-
valor de 72,3 kcal/mol, teniendo la
menor afinidad.
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dad a la estructura, tendiendo a ubi-
carse en la zona central de la molé-
cula al plegarse la estructura
(Caltabiano et al., 2013; Hughes,
2013).
Los péptidos catiónicos son conoci-
dos por tener una alta actividad
frente a bacterias tanto Gram positi-
vas como Gram negativas. Estos pép-
tidos están definidos como cadenas
de entre 15 y 30 residuos de largo,
con una carga neta positiva atribuida
a un exceso de aminoácidos básicos,
además de poseer más del 50 % de
su estructura conformada por ami-
noácidos hidrofóbicos (Lamont et al.,
2015; Vishnepolsky & Pirtskhalava,
2014). Al contrastar los resultados de
la predicción de las propiedades fisi-
coquímicas de la CZS-16 con la in-
formación expuesta, se puede afirmar
que este péptido puede ser catalo-
gado como un péptido catiónico.
La probabilidad de superficie muestra
que la posición de las ventanas 7 y 17
son las que se encuentran más ex-
puestas en la superficie del péptido
(Figura 1), comprendiendo a cada po-
sición de la ventana como una región
contenida de 6 aminoácidos. La po-
sición 7 contiene los residuos
KGVGKA (lisina, glicina, valina, gli-
cina, lisina, alanina) y la posición 17
contiene los residuos VTHLIN (valina,
treonina, histidina, leucina, isoleu-
cina, asparagina). Se puede apreciar
que ambas regiones se encuentran
compuestas por aminoácidos básicos
con carga positiva, rodeados por ami-
noácidos neutrales e hidrofóbicos,
por lo que se puede presumir que
estas zonas acumularán un potencial
positivo siendo focos para interaccio-
nes electrostáticas (Celis et al., 2005;
Soreq, 2012).
La flexibilidad de los péptidos deter-
mina la capacidad de estos para sufrir
cambios conformacionales, lo cual
es crucial al momento de interactuar
con diferentes moléculas como pro-
teínas, enzimas o la misma mem-
brana bacteriana (Craveur et al.,
2015; Fieser et al., 1987). La Figura 2
muestra las posibles regiones rígidas
y flexibles que posee la CZS-16,
siendo flexibles las comprendidas
entre la posición de ventanas 4 y 8,
con la posición 6 como las más fle-
xible. El resto de las posiciones son
regiones rígidas, con la posición 16
como la más rígida. La posición 6
comprende a la sección de la cadena
LKGVGK (leucina, lisina, glicina, va-
lina, glicina, lisina), la cual está con-
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formada por aminoácidos básicos
con carga positiva, rodeados por ami-
noácidos neutrales e hidrofóbicos,
mientras que la posición 16 com-
prende a la sección de la cadena
AVTHLI (alanina, valina, treonina,
histidina, leucina, isoleucina), com-
puesta por un aminoácido básico de
carga positiva rodeado por aminoá-
cidos hidrofóbicos.
Se aprecia que para la CZS-16 se
tiene una tendencia a ser más flexible
en las secciones centrales, lo cual es
contradictorio, pues para este tipo de
moléculas es común que las regiones
extremas sean más flexibles. Al con-
trastar los resultados de flexibilidad
con la predicción de la estructura se-
cundaria se puede apreciar una con-
tracción similar, puesto que la sec-
ción de la cadena correspondiente a
la posición 6 presenta una conforma-
ción alfa helicoidal, que es menos
flexible que la conformación de cola
randómica presente en las zonas ex-
tremas, debido a la formación de
puentes de hidrogeno entre aminoá-
cidos (Jacobs et al., 2001; Lexa &
Carlson, 2012). Aun así, se puede
apreciar que en la estructura optimi-
zada existe una ligera curvatura en la
zona correspondiente a la posición 6
(Figura 5). Por tanto, es necesario un
estudio más detallado mediante téc-
nicas de dinámica molecular, para
poder descartar o corroborar la pre-
dicción de la flexibilidad del péptido.
Figura 5. Sección correspondiente a la
posición de ventana predicha como
más flexible en la CZS-16
Las predicciones de la estructura se-
cundaria de la CZS-16 coinciden en
que el péptido adopta de forma ma-
yoritaria una conformación alfa heli-
coidal (Figura 3), siendo en ambos
casos el 86,96 % de la composición
total, variando únicamente en las
zonas extremas donde el primer (gli-
cina) y los dos últimos residuos (as-
paragina y glutamina) no adoptarán
esta conformación. La predominan-
cia de la estructura alfa helicoidal se
puede dar por la amplia presencia de
aminoácidos neutrales e hidrofóbi-
cos, ya que estos tienden a formar
puentes de hidrógeno entre sí, dando
origen a esta conformación (Meng &
Kurgan, 2016).
MODELAMIENTO MOLECULAR DE LA CRUZIOSEPTINA CC-16
EXTRAÍDA DE LA RANA
Cruziohyla calcarifer
Morales et. al., 135–159
La estructura optimizada muestra una
gran similitud con las predicciones,
pues aún presenta una predominan-
cia de la conformación alfa helicoi-
dal, variando únicamente en la
desestabilización de la estructura he-
licoidal de dos residuos, la fenilala-
nina y la isoleucina, los cuales se
presentan como cola randómica en
la estructura optimizada, exten-
diendo ligeramente esta conforma-
ción en los extremos en comparación
con las predicciones.
Los mecanismos de acción de los
AMPs pueden ser divididos en dos
grupos, modulación inmunológica y
muerte directa. Los mecanismos de
muerte directa son mucho más co-
munes en los AMPs de carácter catió-
nico y pueden ser de dos tipos,
ataque concentrado en la membrana
o no concentrado en la membrana
(Kumar et al., 2018; Vishnepolsky &
Pirtskhalava, 2014). Los estudios de
acoplamiento molecular de la CZS-
16 con diferentes enzimas, cumplen
la función de determinar si el péptido
podría actuar mediante un meca-
nismo de ataque no concentrado en
la membrana por inhibición enzimá-
tica, mientras que los estudios de
acoplamiento molecular de la CZS-
16 con diferentes moléculas presen-
tes en la membrana celular bacte-
riana arrojan información sobre la
interacción individual del péptido
con componentes de la membrana
para determinar un posible meca-
nismo de acción mediante un ataque
concentrado en la membrana.
En el caso del acoplamiento de la
CZS-16 con la proteína de unión de
Penicilina G-acil 2a, el péptido no
podrá inhibir la enzima debido a su
gran tamaño, puesto que éste se en-
cuentra conformado por 342 átomos
a diferencia de su inhibidor, el Cefto-
biprole, con 58 átomos, por lo que
no podrá ingresar de manera efi-
ciente al bolsillo enzimático, además
de que existe una diferencia de car-
gas a pH fisiológico siendo de -1 para
el inhibidor y de +3,1 para el pép-
tido. Algo similar sucede con la Hi-
drolasa AmiA donde su inhibidor, el
Muramil tetrapéptido, posee apenas
4 aminoácidos mientras que la CZS-
16 posee 23, siendo demasiado
grande para interactuar con el bolsi-
llo enzimático.
En el caso de la ADN Girasa B se
puede apreciar que el valor de afini-
dad del péptido es particularmente
149
bajo en comparación con el inhibi-
dor conocido, lo cual se puede dar
debido a la diferencia de tamaños y
cargas entre estos. Aun así, en de la
Figura 6 se puede apreciar una inte-
racción profunda de la lisina 11 (Lys
11) del péptido con el sitio activo de
la enzima, esto debido a que el sus-
tituyente amino positivamente car-
gado de la Lys 11 se encuentra
particularmente expuesto facilitando
así la interacción electrostática con el
sitio activo negativamente cargado.
Figura 6. Interacción de la ADN Girasa B
(azul) con la CZS-16 (amarillo)
El acoplamiento con la proteína de
unión de Penicilina transglicosilasa
1B muestra buena proximidad entre
los valores de afinidad del inhibidor
y el péptido, debido a que la enzima
posee buena exposición del bolsillo
enzimático, dando paso a interaccio-
nes electrostáticas o hidrofóbicas (Fi-
gura 7).
Figura 7. Interacción de la proteína de
unión de Penicilina transglicosilasa 1B
(magenta) con la CZS-16 (verde)
El acoplamiento con la enzima Exo-
B-(1,3)-glucanasa muestra que el
péptido no puede interactuar de ma-
nera directa con el sitio activo de la
enzima, mientras tanto, debido al ta-
maño relativamente pequeño de la
enzima y al gran tamaño del péptido
se puede dar que éste recubra el sitio
activo, impidiendo la entrada del sus-
trato (Figura 8). La Exo-B-(1,3)-gluca-
nasa tiene como función el proveer
de energía a la célula mediante la hi-
drolisis de glucanos, por lo que al im-
pedir la entrada del sustrato se
impide el suministro de energía, cau-
sando la muerte de la célula fúngica.
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MODELAMIENTO MOLECULAR DE LA CRUZIOSEPTINA CC-16
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Cruziohyla calcarifer
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Figura 8. Interacción de la Exo-B-(1,3)-
glucanasa (rojo) con la CZS-16 (azul)
Por otro lado, la Proteasa aspártica
secretada, es una enzima que rompe
los enlaces peptídicos de moléculas
como proteínas o péptidos. Con base
en esto, se puede establecer que la
CZS-16 no podría ser usada como in-
hibidor, puesto que esta se hidroliza-
ría siendo el sustrato mismo de la
enzima.
Los estudios de acoplamiento de la
CZS-16 con diferentes moléculas
presentes en la membrana celular
bacteriana arrojan puntajes de afini-
dad que van desde -2,6 hasta -4,3
kcal/mol, excluyendo a la cardioli-
pina que presentó un valor de afini-
dad de 72,3 kcal/mol. Este puntaje
muestra que existe una interacción
nula entre esta molécula y la CZS-16,
debido a que la cardiolipina es parti-
cularmente voluminosa ya que posee
largas cadenas carbonadas que difi-
cultan la interacción con péptidos
básicos (Cuesta et al., 2019).
La monocapa externa de la bicapa li-
pídica en la membrana bacteriana
está formada principalmente por lípi-
dos con grupos cargados negativa-
mente con los que los AMPs catió-
nicos tienen fuertes interacciones
electrostáticas (Kumar et al., 2018;
Yang et al., 2018). Moléculas como
los glicofosfolípidos, los fosfoamino-
lípidos, el fosfatidilglicerol y la fosfa-
tidiletanolamina, que poseen fuertes
cargas negativas, muestran buena in-
teracción con la CZS-16, por lo que
el péptido podría causar el pliegue de
estas abriendo la membrana bacte-
riana externa, para un posterior ata-
que a la membrana interna (Bechin-
ger & Gorr, 2017; Kumar etal., 2018;
Peters etal., 2010).
La interacción de la CZS-16 con el
ácido teicoico puede causar la aper-
tura de la pared celular bacteriana de
las bacterias Gram positivas, facili-
tando la interacción del péptido con
el lisil-fosfatidilglicerol en la mem-
brana citoplasmática, disminuyendo
las defensas de la célula ante otros
151
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InfoANALÍTICA 9(2)
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péptidos catiónicos. Por otro lado, la
interacción con el beta 1-3 glucano
puede causar la perdida de elastici-
dad de la membrana citoplasmática
fúngica (Piotrowski etal., 2015; Swo-
boda etal., 2010).
CONCLUSIÓN
Los resultados de los estudios com-
putacionales realizados sobre la Cru-
zioseptina CC-16 identificados en la
especie de anfibio Cruziohyla calca-
rifer muestran que este es un péptido
de 23 residuos de largo con una con-
formación alfa helicoidal predomi-
nante, un punto isoeléctrico de
10,73, una carga de +3 de carácter
básica y una carga neta a pH 7 de
+3,1. Además de esto, debido a su
carga neta positiva atribuida a un ex-
ceso de aminoácidos básicos y al
hecho de poseer más del 50 % de su
estructura conformada por aminoáci-
dos hidrofóbicos, se puede clasificar
a la CZS-16 como un péptido antimi-
crobiano catiónico. Los estudios de
acoplamiento molecular muestran
que un mecanismo de acción basado
en inhibición enzimática no es posi-
ble, debido principalmente al ta-
maño del péptido, mientras que un
mecanismo con base en un ataque
concentrado en la membrana micro-
biana puede ser viable, debido a que
la CZS-16 puede causar la disrupción
de la membrana mediante la interac-
ción electrostáticas entre los residuos
con carga positiva y los componentes
de la membrana, como glicofosfolí-
pidos, fosfoaminolípidos, fosfolípi-
dos, etc. con carga negativa, siendo
este el mecanismo de acción más
común entre los AMPs catiónicos
según la bibliografía.
Este trabajo tuvo financiamiento de la
Pontificia Universidad Católica del
Ecuador a través del proyecto
QINV0180-IINV529020200.
AGRADECIMIENTOS
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EXTRAÍDA DE LA RANA
Cruziohyla calcarifer
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