EVALUACIÓN DE LA ACUMULACIÓN DE
CADMIO EN CÉLULAS DE TOMATE DE ÁRBOL
A TRAVÉS DE DETECCIÓN
ELECTROQUÍMICA INDIRECTA
DE PÉPTIDOS RICOS EN CISTEÍNA
EVALUATION OF THE CADMIUM ACCUMULATION IN TAMARILLO
CELLS BY INDIRECT ELECTROCHEMICAL DETECTION
OF CISTEINE-RICH PEPTIDES
Marjorie Montero-Jimenez
1
, Patricio Espinoza-Montero
2,3 *
,
Mauricio Criollo
3
, Mónica Jadán
4
& Lenys Fernández
5,6 *
Recibido: 30 marzo 2018 / Aceptado: 11 junio 2018
DOI: 10.26807/ia.v6i2.77
Palabras claves: Cisteína, contaminación con cadmio, péptidos, tomate de
árbol, Voltamperometría Cíclica.
infoANALÍTICA 6-2
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27
1 Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Química y Agroindustria, Ingeniería Química,
Quito, Ecuador (marjorie.montero@epn.edu.ec)
2 *Escuela de Ciencias Químicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Pontificia Universidad Cató-
lica del Ecuador, Quito, Ecuador (pespinoza646@puce.edu.ec).
3 Escuela Politécnica Nacional, Facultad de Ingeniería Civil y Ambiental, Departamento de Ingeniería
Civil y Ambiental, Centro de Investigación y Control Ambiental, Quito, Ecuador (patoespinozamon@hot-
mail.com; mauricio.criollo@epn.edu.ec).
4 Universidad de las Fuerzas Armadas, Laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, Departamento de Cien-
cias de la Vida y de la Agricultura, Sangolquí, Ecuador (mbjadan@espe.edu.ec)
5 *Universidad Simón Bolívar, Caracas, Venezuela (lfernandez@usb.ve)
6 *Escuela Politécnica Nacional, Escuela de Formación de Tecnólogos, Quito, Ecuador (lenys.fernan
dez@epn.edu.ec)
Keywords: Cadmium pollution, Cyclic Voltammetry, Cysteine, Peptides, Tamar-
illo.
RESUMEN
Mediante la generación electroquímica de yodo se evalúa la acumulación de
Cd(II) por células de tomate de árbol (Solanum Betaceum) a través de la detec-
ción de péptidos ricos en cisteína, compuestos sintetizados por la planta
cuando está contaminada con metales. La curva de calibración obtenida indica
un intervalo lineal de 0 a 250 µmol L
-1
, con un límite de detección de 4,82
µmol L
-1
(3,3 s/m). La concentración de péptidos en las suspensiones celulares
incrementa conforme aumenta la concentración de CdSO
4
y el tiempo de ex-
posición. Los resultados indican que las células de tomate de árbol acumulan
cadmio. Durante 5 días de exposición a 100 µmol L
-1
CdSO
4
las células en sus-
pensión aún no sufren la apoptosis. El método propuesto muestra características
útiles para su implementación en el monitoreo de contaminación por metales
pesados en plantas en crecimiento.
ABSTRACT
The accumulation of Cd(II) by tamarillo (Solanum Betaceum) cells was evalu-
ated through the detection of cysteine-rich peptides. It was used the method of
electrochemical generation of iodine. These compounds are synthesized in the
plant when it is contaminated by metals. The calibration curve obtained indi-
cates a linear range from 0 to 250 µmol L
-1
, with a detection limit of 4.82 µmol
L
-1
(3.3 s/m). The concentration of peptides in cell suspensions increases with
the CdSO
4
concentration and the exposure time. The results indicate that tamar-
illo cells accumulate cadmium. During 5 days of exposure and 100 µmol L
-1
CdSO
4
, the cells of the suspension still do not suffer from apoptosis. The pro-
posed method shows useful characteristics for monitoring heavy metals in grow-
ing plants.
infoANALÍTICA 6-2
Julio 2018
28
29
El cadmio es un elemento que está
presente en agua, suelos y fertilizan-
tes. Las plantas no lo necesitan en su
organismo, sin embargo, puede ab-
sorberse fácilmente a través de las raí-
ces y en caso de plantas de consumo
humano, transferirse a las personas a
través de la cadena alimenticia (Ló -
pez et al., 2014; Šelešovská et al.,
2007). La ingesta de alimentos conta-
minados con metales pesados de
forma prolongada puede causar un
grave impacto en la salud de los seres
vivos ya que estos son bioacumula-
bles y muy tóxicos (Reyes et al.,
2016).
Cuando la planta está contaminada
con este tipo de metales, se altera el
equilibrio redox y espontáneamente
generan péptidos ricos en cisteína
como fitoquelatinas y glutatión, con
la finalidad de mantener el equilibrio
intracelular para que las funciones de
la célula (la transducción de señales,
el metabolismo y la regulación de
genes) no se alteren (Lv et al., 2016;
Šelešovská et al., 2007).
Existen varios métodos de detección
de péptidos ricos en cisteína como la
fluorescencia (Niu et al, 2012), cro-
matografía (Careser et al, 2001), co-
lorimetría (Li et al, 2014) y espec-
troscopia de masas (Dieckhaus et al.,
2005); estos métodos resultan ser
costosos, requieren de un tiempo re-
lativamente largo de análisis y trata-
mientos laboriosos de la muestra (Ju,
Zhan & Chen, 2016; Lv et al., 2016,).
Las técnicas electroquímicas como
alternativa tienen una alta aceptación
debido a la sensibilidad que presen-
tan y a los tiempos cortos de res-
puesta para realizar una medida,
además de ser técnicas económicas
(Wang et al., 2017).
Los halógenos reaccionan con los
orgnanosulfuros, donde es de interés
la reacción con el grupo tiol. El yodo
tiene la ventaja de ser selectivo de
modo que solo reacciona con el sul-
furo en estado reducido para la oxi-
dación de RSH (péptido reducido) a
RSSR (péptido oxidado) (Anjum et al.,
2014; González, Valero & Compton,
2016). La reacción de oxidación se
puede monitorear electroquímica-
mente en presencia de yodo utili-
zando electrodos de platino (Valero
et al. 2016). El platino tiene propie-
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INTRODUCCIÓN
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30
dades catalíticas y resistencia a la co-
rrosión, lo que ha hecho que se em-
plee en la construcción de sensores
electroquímicos (Xu & Zhang, 2014;
Bentley et al., 2013). El método ha
sido aplicado en hojas de alverjas
(González et al., 2016).
Fojta et al., (2006) estudió la conta-
minación por cadmio en extractos
celulares de tabaco para cuantificar
los niveles de péptidos ricos en cis-
teína. Sin embargo, no existen repor-
tes en la literatura de estudios en
tomate de árbol (Solanum Beta-
ceum), el cual es un fruto que se pro-
duce en varias ciudades de Ecuador
y se comercializa en mercados loca-
les (León, Viteri & Cevallos, 2004). El
tomate de árbol es una planta de gran
interés en Latinoamérica y algunos
países de Europa, por su contenido
nutricional en vitaminas (provitamina
A, vitamina B6 y vitamina C) y en mi-
nerales esenciales (Ca, Fe, P y Mg)
(Aharana, Cabrera & Torres, 2010;
Sandoval & Calispa, 2015; Torres,
2012), sin embargo, por el uso de
pesticidas, fertilizantes, mal manejo
de suelos o agua, existe la posibilidad
de contaminación en las frutas, en es-
pecial de metales pesados (Martí,
Burba & Cavagnaro, 2002).
La cuantificación de péptidos ricos
en cisteína a nivel celular es de im-
portancia, debido al control que se
puede lograr a nivel de laboratorio de
parámetros como la temperatura, nú-
mero de células y los nutrientes que
se suministran; además se puede co-
nocer aspectos del cultivo como el
comportamiento metabólico. Ade-
más, los tiempos de crecimiento de
las células son menores que la planta
(Sánchez y Alvarenga, 2015), lo que
conlleva a un rápido diagnóstico para
generar conocimiento de este tipo de
sistemas, que en el futuro permita es-
calar el estudio al monitoreo real en
plantas ya desarrolladas y formadas.
En este trabajo, se propone estudiar
la detección electroquímica indirecta
de péptidos ricos en cisteína en célu-
las de tomate de árbol.
El método fue optimizado utilizando
“glutatión”, como péptido modelo de
mayor abundancia en la naturaleza,
a través de la generación de yodo
electroquímicamente y siguiendo su
reacción con el péptido.
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Reactivos
Los reactivos empleados fueron gra -
do analítico y las soluciones prepara-
das con agua ultra pura de 18 MΩ
cm
-
1
. Bacto Agar (Biomark). Macronu-
trientes: CaCl
2
(Fisher Chemical, 100
%), KH
2
PO
4
(Himedia, 99 %),
KNO
3
(Merck, 99%) MgSO
4
·7H
2
O
(Mallinckrodt Chemicals, 100%) y
NH
4
NO
3
(Merck, 98,5%). Micronu-
trientes: CoCl
2
·6H
2
O (Sigma,
100 %), CuSO
4
·5H
2
O (Himedia,
99,5%), FeNaEDTA (Sigma, 99%),
H
3
BO
3
(AMP, 99,8 %), KI (Fisher
Scientific, 99,5%), MnSO
4
·H
2
O (Hi-
media, 98%), Na
2
MoO
4
·2H
2
O (Fis-
her Chemicals, 99,8 %) y
ZnSO
4
·7H
2
O (Lobachemie, 99,5%).
Vitaminas: glicina (Sigma, 99 %),
mio-inositol (Lobachemie, 99 %),
ácido nicotínico (Lobachemie,
99,5 %), piridoxina HCl (Sigma,
99%) y tiamina HCl (Lobachemie,
99%). Fitohormonas: 2,4-D (Loba-
chemie, 98 %), ANA (Lobachemie,
99%). Para evaluar del método: KI
(HVO, 100 %), H
2
SO
4
(Merck,
98 %), K
2
SO
4
(Sigma, >98 %), L-
Glutatión reducido (Sigma, >98%),
NaCl (Baker, 100 %), KCl (Merck,
>99,5%) y Na
2
HPO
4
(Fisher Scien-
tific, 100%).
Obtención de extractos celulares
Se sembraron semillas de tomate de
árbol “in vitro”. Las semillas se colo-
caron en alcohol al 70 % durante 3
min, luego se lavó con agua destilada
estéril, seguido se lavó con hipoclo-
rito de sodio al 2,5 % con 4 gotas de
tween 20 durante 15 min, finalmente
se enjuagó con agua destilada estéril
(Borrero, 2007). Las semillas desin-
fectadas se sembraron en el medio de
cultivo Murashige and Skoog (MS),
suplementado con 30 g L
-1
de saca-
rosa y 7,5 g L
-1
de agar. Las semillas
fueron expuestas a un fotoperíodo de
16horasluz / 8horasoscuridad, para
posteriormente realizar la multiplica-
ción de brotes (Aharana et al., 2010).
Se tomaron explantes de hojas y ta-
llos para inducir a la formación de
callo embriogénico, se empleó me -
dio MS suplementado con 30 g L
-1
de
sacarosa, 7,5 g L
-1
de agar y con dife-
rentes concentraciones de auxinas in-
ductoras de callo: 0,5 y 1 mg L
-1
de
ácido 2-dicloro fenoxiacético (2,4-D)
y 5 y 7 mgL
-1
de ácido naftalenacé-
MATERIALES Y MÉTODOS
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Julio 2018
32
tico (ANA). Para el análisis estadístico
se utilizó un diseño experimental
completamente al azar con un solo
factor categórico (Aharana, et al.,
2010). Se cortó la parte suave del
callo y se colocó en MS suplemen-
tado con la sacarosa y auxina (sin el
agar) en las mismas condiciones en
las que se produjo el callo y se ex-
puso a agitación orbital. A continua-
ción, se conformó un subcultivo de
las suspensiones celulares para elimi-
nar grumos no disgregados, mediante
una dilución 1 a 3. Dos semanas des-
pués se realizó un conteo de células
con la cámara de neubauer en 5
muestras durante 5 días y se midió la
turbidez de las suspensiones celula-
res (Sánchez & Avarenga, 2015).
Optimización del método analítico
Se realizaron voltametrías cíclicas
sobre electrodos de platino, utili-
zando una celda de un comparti-
miento y tres electrodos, un elec-
trodo de referencia de Ag/AgCl y un
contraelectrodo de grafito (5 cm de
largo) (Lee, Goncalves & Compton,
2015). Se empleó glutatión como
péptido modelo en concentraciones
de 10, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200,
250 µmol L
-1
. El electrolito soporte
fue K
2
SO
4
0,2 mol L
- 1
con KI 1
mmol L
-
1
(Lv et al., 2016). La curva
de calibración con mejor coeficiente
de determinación se obtuvo reali-
zando Voltamentrías Cíclicas del
blanco previa medida del analito (Ba-
rrio et al, 2005; Grajales, Palacios &
López, 2007). Se realizaron pruebas
de repetibilidad, para lo cual un téc-
nico midió una muestra tres veces el
mismo día y pruebas de reproducibi-
lidad, para lo cual se midió una
muestra tres veces en días diferentes
y por técnicos diferentes (Rodríguez,
Hung & Lavaut, 2009; Boqué et al.,
2002).
Medición de contaminación por cad-
mio en las suspensiones celulares
Las mediciones se realizaron em-
pleando curvas de calibración por
adición estándar con un volumen de
muestra de 2 mL (Fojta et al., 2006),
en un medio suplementado con sul-
fato de potasio 0,2molL
-1
(o sulfato
de cadmio) y yoduro de potasio 1
mmol L
-1
(González et al., 2016), me-
diante Voltametría Cíclica en un Po-
tenciostato (CH Instruments).
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La Tabla 1, resume los porcentajes de
muestras sembradas que generaron
callo embriogénico; los medios 1 y 2
corresponden a aquellos que tienen
0,5 y 1 g L
-1
de 2,4-D, respectiva-
mente mientras que los medios 3 y 4
corresponden a los que contienen 5
y 7 gL
-1
de ANA, respectivamente.
Tabla 1. Porcentaje de formación de
callo embriogénico
Tallo Hojas
Medio % 1 % 2 % 1 % 2
1 70 65 10 10
2 90 95 0 10
3 30 40 50 50
4 10 10 25 30
Valor p 0,002 0,0011
En la Figura 1, se muestran fotografías
de las plantas y callos de tomate de
árbol a diversos tiempos de siembra.
Figura 1. Imágenes de (a) plantas, (b)
siembra de tallos, (c) callo de dos se-
manas y (d) callo de 4 semanas
RESULTADOS
Figura 2. Número de células versus
turbidez de la suspensión
La Figura 3 muestra imágenes de las células en el microscopio óptico.
Figura 3. Imágenes de las suspensiones de tomate de árbol
en el microscopio óptico (10x)
34
infoANALÍTICA 6-2
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La Figura 2 muestra la curva de crecimiento de las células y su relación con la
turbidez.
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En la Figura 5 se muestra la curva de
calibración construida sobre el elec-
trodo de Pt.
Figura 5. Curva de calibración
de glutatión reducido
La Tabla 2 muestra el coeficiente de
variación para la repetibilidad, repro-
ducibilidad y el coeficiente de deter-
minación.
Tabla 2. Resultados de la repetibilidad,
reproducibilidad y linealidad
Parámetro Aceptación* Resultado
Repetibilidad CV < 2 % 1,57 %
Reprodu-
cibilidad
CV < 3 % 2,25 %
Linealidad r
2
> 0,98 0,9965
* De acuerdo con lo reportado por Vázquez, 2008.
La Figura 4, muestra las voltametrías cíclicas de 1 mmol L
-1
de KI en ausencia
(Blanco) y en presencia de glutatión reducido.
Figura 4. Voltametrías cíclicas de una solución 1 mmol L
-
1
de KI
en presencia de diferentes concentraciones de glutatión reducido,
a una velocidad de barrido de 0,1 V s
-1
35
0,0 0,20,40,60,8
-10
0
10
20
0
m
ol L
-1
10
m
ol L
-
1
20 mol L
-1
30
m
ol L
-1
50 mol L
-1
100 mol L
-1
150 mol L
-1
200 mol L
-1
250 mol L
-1
Corriente /
10
Potencial / V (
vs.
Ag/AgCl)
La Figura 6 muestra la relación de la concentración de péptidos ricos en cisteína
en función del tiempo de exposición de las células, a diferentes concentracio-
nes de CdSO
4
.
Figura 6. Relación entre la concentración de péptidos
y el tiempo de exposición
36
infoANALÍTICA 6-2
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DISCUSIÓN
Obtención de los extractos celulares
Las semillas germinaron seis semanas
a partir de la siembra (Figura 1.a), seis
semanas después de la germinación se
realizó la primera multiplicación de
brotes (Figura 1.b). Debido a que el
valor p (Tabla 1) es menor a 0,005 se
concluye con un 95 % de confianza,
que entre los tratamientos aplicados
para la formación de callo embriogé-
nico en los explantes que al menos un
tratamiento es mejor que los demás. El
callo (Figura 1.c y 1.d), creció a partir
de la segunda semana; aquel que se
formó a partir de hojas es más pe-
queño y tiene un tiempo de vida de
cuatro semanas, en contraste el for-
mado a partir de tallo tiene tiempo de
vida de hasta seis semanas. Al utilizar
los tallos de la planta hay un mayor
porcentaje de formación de callo que
al usar hojas, motivo por el que se eli-
gió trabajar con el tallo de la planta,
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en el medio que presenta mayor por-
centaje de muestras que generan
callo (medio MS suplementado con
30 g L
-1
de azúcar y 1mg L
-1
de 2,4-
D). El callo inducido de tallos crece
a partir de la segunda semana. Con
un callo de cuatro semanas se reali-
zaron las siembras en medio líquido
para la formación de suspensiones
celulares.
La turbidez de las suspensiones tiene
una relación directamente proporcio-
nal con el número de células (Figura
2). En el inserto de la Figura 2 se pue-
de observar que la turbidez aumenta
con el paso del tiempo, lo que indica
que las células se reproducen en el
medio líquido MS suplementado con
30 g L
-1
de azúcar y 1 mg L
-1
de 2,4-D.
En la Figura 3, se puede observar que
las células no forman grandes agru-
paciones, lo que sugiere que las sus-
pensiones están listas para realizar el
monitoreo, ya que por definición, las
suspensiones celulares son células li-
bres dispersas en medio líquido que
se mantiene en movimiento (Carrera,
2014).
A medida que aumenta la concentra-
ción del analito (Figura 4), la altura
del pico de oxidación correspon-
diente a la transformación de I
-
a I
2
a
0,6 V aumenta, y el pico de reduc-
ción a 0,5 V disminuye, producto del
proceso catalítico del reactivo en el
medio (KI) que hace posible la oxida-
ción del péptido. Los resultados su-
gieren que se puede seguir la señal
para la medición del péptido, de
acuerdo con las siguientes reaccio-
nes (González et al., 2016; Lee, et al.,
2015):
La curva de calibración (Figura 5)
construida sobre el electrodo de Pt
arrojó un coeficiente de determina-
ción r
2
=0,9972. El límite de detec-
ción fue 4,82µmolL
-1
(3,3 s/m) y el
límite de cuantificación 15,41 µmol
L
-1
(10 s/m). La Tabla 2 muestra que
los parámetros analizados están den-
tro de los criterios de aceptación ex-
puestos por Vázquez en el 2008, es
decir el método puede considerarse
confiable.
37
Evaluación de la contaminación por
cadmio en las suspensiones celulares
Las medidas expuestas en la Figura 6,
se realizaron mediante curvas de ca-
libración por adición estándar para
minimizar los efectos de la matriz de
la muestras (Boqué, 2005). Cuando
las células están libres de cadmio, las
concentraciones de péptidos ricos en
cisteína son cercanas a cero, lo que
indica que las células no están ex-
puestas a algún tipo de contamina-
ción o estrés. A medida que pasan los
días de exposición, las concentracio-
nes de péptidos presentes en las
muestras incrementan con el au-
mento de la concentración de cad-
mio. Las células expuestas a la mayor
concentración de CdSO
4
(100 µmol
L
-1
) presentan un incremento signifi-
cativo en la generación de péptidos
solo hasta el tercer día; los siguientes
días los valores fueron muy pareci-
dos, lo que indica que las células
próximamente entrarán en la apopto-
sis (muerte celular programada), ya
que se ha reportado que la concen-
tración de péptidos se mantiene
constante antes que la célula induzca
su muerte, y en el momento de la
muerte existe un incremento en la
concentración del péptidos (Fojta et
al., 2006). En nuestros estudios, este
aumento brusco en la señal que se
sigue, no se manifestó. Las medidas
indican que el cadmio ingresa a la
estructura de las células y por ende
se acumula dentro de ellas.
De acuerdo con estos resultados pre-
liminares, consideramos que el mé-
todo puede ser utilizado para el
monitoreo de la contaminación por
metales pesados de plantas comple-
tamente formadas. Un estudio en la
planta completamente formada per-
mitiría determinar si el cadmio llega
a los frutos de esta. Acosta & Pozo
(2013), realizaron estudios de cad-
mio en cacao, y Lopéz (2017) de
cadmio en soya. En las dos investiga-
ciones, se determinó que las plantas
de prueba son capaces de acumular
cadmio. Se espera que el tomate de
árbol no acumule cadmio en los fru-
tos, debido a que Narváez et al.
(2013), reportaron que en plantas de
tomate de riñón expuestas a lodos re-
siduales con metales pesados, no se
encontró presencia de metales pesa-
dos en los frutos.
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EVALUACIÓN DE LA ACUMULACIÓN DE CADMIO EN CÉLULAS DE TOMATE DE ÁRBOL
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Montero et al, 27-43
La detección de péptidos ricos en cis-
teína mediante voltametría cíclica en
presencia de yodo, es una tecnología
que permite alcanzar límites de de-
tección de péptidos ricos en cisteína
de 4,82µmolL
-
1
y un límite de cuan-
tificación de 15,41µmolL
-1
. Al apli-
car esta técnica en la cuantificación
de péptidos en células de tomate de
árbol cultivadas in-vitro se verificó
que estas acumulan cadmio, me-
diante la cuantificación de péptidos
en las suspensiones celulares. La
concentración de péptidos incre-
menta conforme aumenta la concen-
tración de CdSO
4
y el tiempo de
exposición. Con 100 µmol L
-1
CdSO
4
y 5 días de exposición las células de
la suspensión aún no sufren la apop-
tosis. Por lo tanto, el método eva-
luado es confiable para medir
péptidos ricos en cisteína en sistemas
reales.
39
CONCLUSIONES
LISTA DE REFERENCIAS
Acosta, S., & Pozo, P. (2013). Determinación de cadmio en la almendra de cacao (Theo-
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